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實時熒光定量PCR常見問題及注意事項

發布時間: 2020-12-29   

常見問題分析

1. 做標準曲線時候,可否用2個不同體系濃度的稀釋分別對于內參和目的基因?

建議最好用同樣稀釋倍數做曲線,因為模板濃度會影響擴增效率。

2. 熔解曲線中,Tm不出現在80度左右?

擴增片段100bp左右的,一般應該出現在80度左右。如果低于此溫度出現,可能是模板降解。

3. 擴增曲線沒有Ct值,僅僅一條斜線?什么原因?

模板濃度過低或者模板降解。

4. 如果內參和目標基因表達量差別比較大,也就是目的基因的表達量少,

Ctcon=15,Cttarget=38,可否應用?

可以用于數據分析。因為表達量低,從而用過高模板進行擴增,從而同內標的模板不同,反而會增大數據統計的誤差。

5. 引物濃度可否是50nM,是否太低?

如果擴增曲線和熔解曲線比較好,這個濃度當然可以。如果更低,擴增結果好的情況下,同樣可以運用。

一句話,所有的模板、引物等濃度盡量不要用高的,會影響擴增效率。

6. miRNA多個擴增時候,如果一個的擴增效果比較,其它熔解曲線不止一個峰,如何解決?

Primer對于miRNA是專一的。所以重新設計引物是不可取的。那么只能是提高Tm或者更換mastermix等。反應體系會影響反應產物的。

7. 相對定量方法,如果用Ct值比較,是各個樣品平均后在2delt Ct還是分別2 delt Ct在平均比較好?

相對定量的方法各有優缺點,主要取決于實驗的目的和材料的準備。如果是材料群體個體差異不大,這2種方法基本沒有很大的區別;如果是個體差異比較大,建議用雙標準曲線做。就是分別做內參和目的基因的標準曲線,分別帶入Ct值計算。

8. 熔解程序可否不加?

如果是擴增效果好,特異擴增,可以不加熔解程序;但建議做好加上。

9. 擴增反應體系5uL,擴增效率低,什么原因?

反應體系小,各種因素的影響比較大,比如引物濃度、模板濃度及其金屬離子等會影響擴增效率的。

10. 如何減少非特異性擴增的干擾?

設計一對好引物,提高primer的退火溫度,以及設定吸光溫度。



其他注意事項:   按照正確的開關機順序操作,有助于延長儀器的使用壽命,減少儀器出故障的頻率。開機順序:先開電腦,待電腦完全啟動后再開啟定量PCR儀主機,等主機面板上的綠燈亮后即可打開定量PCR的收集軟件,進行實驗。關機順序:確認實驗已經結束后,首先關閉信號收集軟件,然后關掉定量PCR儀主機的電源,最后關閉電腦。 2.        應該定期備份您的實驗數據,備份頻率推薦每周一次,用光盤刻錄。同時您也應該備份定量PCR儀的各種純熒光光譜校正文件、背景文件和安裝驗證實驗數據, 3.        良好的實驗室環境有助于延長儀器的使用壽命,減少儀器出故障的頻率。推薦做到以下幾個方面: 電源:推薦配備合適的UPS或穩壓器。 通風:儀器的通風應該沒有阻擋。 溫度:推薦實驗室配備空調,溫度應該控制在10-30°C之間。 濕度:20-80%;對于潮濕的省份,推薦實驗室配備除濕機。 空間:易于操作,安全。 4. 怎樣判斷定量PCR儀的樣本加熱塊是否被污染?怎樣清除污染     一個辦法是運行背景校正反應板,當一個或多個反應孔連續顯示出不正常的高信號,則表明該孔可能被熒光污染物。另外一種辦法是在不放任何物品到樣本塊上的前提下,執行ROI的校正,當某個孔的信號明顯高出其他孔時,則表明該孔被污染。     清除樣本加熱塊污染的步驟如下:用移液器吸取少量乙醇并滴入每個污染的反應孔中。 吹打數次。 將廢液吸入廢液杯中。重復以上步驟:乙醇三次,去離子水三次。確認反應孔中的殘留液體蒸發完。


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